百萤课堂之APC与抗体的缀合实验方案
发布日期：2024-10-29 点击次数：
2.使用1.7毫克APC 修饰每毫克lgG, 包括在缓冲液交换过程中损失的额外10%★★■。
注意：对于失败或效果较差的结合，增加或减少SMCC 相对于APC 的量，可能会有所好转■◆★★◆■。
2.1gG溶液浓度应为 4 mg/ml或更高，这样效果比较好。还原几乎可以在任何缓冲液中进行；MES 、磷酸盐和 TRIS 缓冲液(pH 范围为6至8)已被验证可以使用■■◆◆。如果抗体浓度低于2mg/ml◆★★，则应浓缩。缓冲液交换柱上的损失应额外增加
1.每毫克IgG 添加1.5毫克SMCC-APC 。用铝箔包裹反应管并在室温下旋转60 分钟。注意：这些摩尔比( 每 1gG 约2个APC)效果很好★■■■。对于失败或效果不佳的结合★◆◆，不同的摩尔比可能会有所帮助◆◆◆■■。
2◆★◆■.每毫克APC加入6μlSMCC,并进行涡旋。将反应管用铝箔包好★◆◆，室温下旋转60 分钟。
4.将还原的lgG 通过预平衡的“交换缓冲液”过滤柱。收集0★◆■◆.25毫升的级分，测定蛋白浓度，并将含有大部分lgG 的级分汇集在一起◆■★。可以通过分光光度法或比色法完成。
的纯化可能需要24-48小时。除了下面列出的材料外，您还需要浓度至少为2mg/ml的抗体溶液。请您在进行APC抗体缀合实验之前熟悉如何使用脱盐柱以及如何获取吸光度光谱。
注意：APC在缀合前作为SAS(硫酸铵钠)沉淀物最稳定◆◆■★★■。如果将APC 以SAS沉淀物的形式储存◆★■◆★，则必须在使用前进行大量纯化。在用每毫升1升的“透析缓冲液◆■■◆”透析之前，用每毫升1升APC 的PBS进行透析2 次。
3■◆◆◆.用DTT配制20mMlgG溶液：每毫升 IgG溶液加入20μlDTT 原液并搅拌。室温下静置30分钟，无需额外搅拌 (以尽量减少半胱氨酸再氧化为胱氨酸)■★■◆◆■。
注2:SMCC-APC缀合物非常稳定(在“交换缓冲液■★★■”中，在4℃下至少可以稳定几个月)。因此◆★■■，如果您需要节省一部分时间，可以选择同时缀合10毫克或更多的APC,并将其用于几次抗体实验(在几周内)。SMCC-APC的长期储存最好是作为饱和硫酸铵沉淀物■■■◆◆。
